熒光原位雜交是一門(mén)新興的分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是 20 世紀(jì) 80 年代末期在原有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種非放射性原位雜交技術(shù)。那么影響熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)的因素有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、固定液的選擇及固定時(shí)間

①石蠟組織建議用10%中性緩沖福爾馬林固定12～48h，其它固定液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能產(chǎn)生一定的影響。

②組織標(biāo)本離體后應(yīng)盡快固定，較大標(biāo)本切開(kāi)固定。如樣本固定不及時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)減弱。（尤其環(huán)境溫度較高時(shí)更應(yīng)及時(shí)固定）

③固定液體積應(yīng)不少于標(biāo)本體積的10倍，否則固定不充分，容易出現(xiàn)無(wú)信號(hào)或者信號(hào)很弱的現(xiàn)象。

④為了保證信號(hào)的準(zhǔn)確性，蠟塊最好在2年內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，已經(jīng)切好的切片在6周內(nèi)檢測(cè)最佳。

二、組織切片和載玻片的選擇

組織切片4～5μm厚，過(guò)厚或過(guò)薄的切片均會(huì)對(duì)信號(hào)的強(qiáng)弱產(chǎn)生影響，切片過(guò)厚將導(dǎo)致雜交不充分，最終信號(hào)點(diǎn)發(fā)生重疊，影響計(jì)數(shù)。而且切片應(yīng)完整，質(zhì)量良好，否則會(huì)在預(yù)處理時(shí)掉片。

載玻片的選擇建議使用防脫載玻片，有條件的實(shí)驗(yàn)室可使用更好的陽(yáng)離子或者陰離子專用載玻片，可有效防止脫片現(xiàn)象的發(fā)生。

三、切片的預(yù)處理

切片預(yù)處理過(guò)程包括煮沸處理和蛋白酶消化。

①當(dāng)組織處理不規(guī)范、切片過(guò)厚或烤片不足時(shí)，在煮沸過(guò)程中容易掉片，建議烤片溫度在56℃過(guò)夜。煮沸過(guò)程中要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)溫度和時(shí)間。

②酶消化是FISH實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟之一，如果對(duì)組織不熟悉，可以先消化推薦的反應(yīng)時(shí)間，然后復(fù)染DAPI在熒光顯微鏡下觀察，在DAPI通道下，以細(xì)胞既無(wú)空洞(消化過(guò)度)，亦無(wú)明顯的云霧狀(消化不足)為最佳，同時(shí)可切換觀察紅綠通道，以紅綠通道無(wú)明顯的背景為佳，如果背景較高，可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。

③對(duì)于陳舊的石蠟組織切片，要適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)大量的自發(fā)熒光。

四、變性和雜交

變性和雜交是本實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的步驟，變性的時(shí)間和溫度是雜交成功是否的關(guān)鍵，變性和退火溫度對(duì)熒光信號(hào)影響較大，變性和退火溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致雜交效率變低，使熒光信號(hào)變?nèi)酰冃院屯嘶饻囟冗^(guò)高易出現(xiàn)高背景。

為保證變性期間溫度的穩(wěn)定，建議采用專業(yè)的原位雜交儀進(jìn)行變性和雜交步驟，不僅能夠減少實(shí)驗(yàn)的繁瑣性，而且更有利于實(shí)驗(yàn)條件的控制，比如時(shí)間、溫度和避光條件等。

為避免雜交液在變性和雜交過(guò)程中的損失和防止干片，一定要在蓋玻片的四周用橡膠水泥進(jìn)行密封。

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