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如何提高DNA純度測(cè)定的準(zhǔn)確性?

 更新時(shí)間:2023-10-10 點(diǎn)擊量:749

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常需要對(duì)樣本進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定,它相當(dāng)于一種質(zhì)控,以此來確保下游實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可靠。那么該如何提高DNA純度測(cè)定的準(zhǔn)確性呢?讓我們一起來看看吧!

常用的DNA濃度/純度測(cè)定設(shè)備是紫外分光光度計(jì),它的原理是利用物質(zhì)分子對(duì)紫外可見光譜區(qū)的輻射吸收來進(jìn)行分析物質(zhì)成分。假設(shè)現(xiàn)在有一樣物質(zhì)A,它溶解在溶液內(nèi),當(dāng)光照射溶液時(shí),溶液內(nèi)的A會(huì)吸收一部分的光。不同顏色的光有不同的波長(zhǎng),A對(duì)不同顏色的光(不同波長(zhǎng))的吸收程度是不一樣的。

雙鏈的DNA,它能對(duì)波長(zhǎng)為260nm的光進(jìn)行強(qiáng)烈的吸收,吸收的程度可以用一個(gè)叫吸光度的數(shù)值來測(cè)量,濃度越高的DNA,理論上吸光度也越高。

最后,通過與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度數(shù)值對(duì)比后,就可以知道未知濃度的DNA有多少量了。

DNA濃度測(cè)定通常會(huì)使用紫外分光光度計(jì),常見的有NanoDrop這類設(shè)備。除了DNA,它還能測(cè)定RNA和蛋白的吸光度。

要提高濃度測(cè)定的準(zhǔn)確性,需要注意以下幾點(diǎn):

1. 檢測(cè)之前,務(wù)必充分混勻DNA溶液,因?yàn)檫@類機(jī)器的上樣檢測(cè)體積只需要1-2uL,如果樣品沒有混勻,那么每次檢測(cè)樣品濃度也會(huì)不一樣。

2. 因?yàn)樯蠘芋w積很小,所以樣品很容易揮發(fā),如果把樣品加在檢測(cè)基座后不馬上檢測(cè)的話,會(huì)導(dǎo)致測(cè)出來的樣品濃度偏高。

3. 實(shí)驗(yàn)環(huán)境和耗材的穩(wěn)定性要高。檢測(cè)設(shè)備應(yīng)該在放置在溫度可控、通風(fēng)的環(huán)境下;裝樣品的管子如果不是要進(jìn)行吸取樣品操作的話,需要時(shí)刻緊閉。

4. 每次檢測(cè)完畢,都需要對(duì)檢測(cè)基座或者比色皿進(jìn)行清洗和擦拭,確保不會(huì)有樣品殘留后,再進(jìn)行下一次上樣檢測(cè)。

5. 空白調(diào)零,應(yīng)該使用溶解待檢測(cè)樣品的溶液來調(diào)零。例如如果用水溶解DNA,那就用水調(diào)零,用其他緩沖液溶解,則用對(duì)應(yīng)的緩沖液調(diào)零。

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