原理

通過生物分子之間的特異性相互作用來分離物質(zhì)的一種層析方法。包括基于空間結(jié)構(gòu)特異結(jié)合的抗原/抗體，酶/底物、底物類似物、抑制劑、激活劑、輔因子，激素/受體，核酸/核酸結(jié)合蛋白、互補(bǔ)核酸序列，和基于電子的供體和受體相互作用的金屬螯合、嗜硫親和等。該分離純化蛋白的方法高效、簡(jiǎn)單、快速、選擇性高。

用途

分離、純化蛋白

材料與儀器

樣品；親和層析柱；結(jié)合緩沖液；洗脫緩沖液。

步驟

①準(zhǔn)備層析柱，根據(jù)目標(biāo)蛋白量和填料載量確定柱體積；

② 準(zhǔn)備樣品，通過過濾或離心除去顆粒性物質(zhì)，確保樣品中不含干擾結(jié)合的物質(zhì)，根據(jù)不同的親和層析類型調(diào)整上樣緩沖液 pH；

③ 上樣前用上樣緩沖液平衡柱子或珠子，柱子需根據(jù)結(jié)合能力強(qiáng)弱確定上樣流速；

④ 孵育，對(duì)于親和磁珠需將樣品、抗體、珠子 4℃ 孵育一段時(shí)間后再進(jìn)行洗脫；

⑤洗脫，對(duì)于組蛋白標(biāo)簽蛋白采用咪唑或低 pH 鹽溶液洗脫、對(duì)于 GST 融合蛋白采用含 10-20 mM 還原性谷胱甘肽的溶液洗脫、對(duì)于金黃色葡萄球菌蛋白 A 采用低 pH 鹽溶液洗脫；

⑥ 對(duì)于親和層析柱可以用結(jié)合緩沖液重新平衡柱子或用儲(chǔ)存液沖洗柱子，再生利用。

注意事項(xiàng)

1、帶不同標(biāo)簽的待純化蛋白要根據(jù)標(biāo)簽的差異選擇不同的洗脫方法，常用的洗脫緩沖液有高鹽洗脫液、低 pH 洗脫液、還原谷胱甘肽洗脫緩沖液、EDTA 洗脫液等；

2、Ni 親和層析柱可分為 Ni-IDA (螯合三價(jià))和 Ni-NTA (螯合四價(jià))，IDA 載量要比 NTA 高，IDA 與蛋白結(jié)合能力弱、穩(wěn)定性差、Ni易脫落，純化回收 His 標(biāo)簽蛋白選擇螯合鎳更穩(wěn)定、更耐受還原劑、特異性更高的 NTA 層析柱更好；

3、GST 親和層析的條件更溫和、更能保證蛋白活性；

4、純化回收過程中要添加穩(wěn)定蛋白的蛋白酶抑制劑、根據(jù)親和原理合理添加金屬螯合劑、離子穩(wěn)定劑和還原劑。

常見問題

1、Ni 柱進(jìn)行蛋白純化需要注意什么?

緩沖液中不能有高濃度的電子供體基團(tuán)、不能有強(qiáng)螯合劑、不能有高濃度強(qiáng)還原劑、不能含離子型去垢劑、避免含碳酸氫鈉等物質(zhì)；

2、GST 蛋白純化需要注意什么？

避免蛋白樣品超聲太劇烈或時(shí)間過長(zhǎng)引起的蛋白變性，增加洗脫緩沖液的 pH 值可在不增加還原谷胱甘肽濃度的情況下提高洗脫效率；

3、Protein A 純化蛋白需要注意什么？

要保證 Protein G 和抗體有充分的結(jié)合時(shí)間，抗體純度不夠會(huì)導(dǎo)致雜蛋白含量高、易引起蛋白沉淀。

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